傳統(tǒng)的高通量測(cè)序是對(duì)某一組織整體的細(xì)胞合集進(jìn)行測(cè)序和分析，而某一個(gè)細(xì)胞的基因信息則會(huì)被整體覆蓋。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)基因組與表型之間的關(guān)系認(rèn)識(shí)越來(lái)越深刻，單個(gè)細(xì)胞也有可能攜帶重要的信息。
10x單細(xì)胞測(cè)序是使用10x Genomics平臺(tái)，將單細(xì)胞懸液中的每個(gè)細(xì)胞分別進(jìn)行標(biāo)記，再通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄和PCR建庫(kù)測(cè)序，分析單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息。單細(xì)胞測(cè)序可以揭示復(fù)雜細(xì)胞群體的異質(zhì)性，避免單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)信號(hào)被群體的平均化所掩蓋。
1、10x單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)方案
測(cè)序策略：Illumina平臺(tái)PE150
數(shù)據(jù)量與捕獲的細(xì)胞數(shù)量相關(guān)，捕獲細(xì)胞越多，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量也越多，具體如下：
2、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)優(yōu)勢(shì)
（1）精準(zhǔn)分選：利用10x Genomics平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)真正的單細(xì)胞測(cè)序；
（2）細(xì)胞捕獲率高達(dá)65%，可實(shí)現(xiàn)大量單細(xì)胞的快速高效標(biāo)記、測(cè)序和分析；
（3）項(xiàng)目周期短，技術(shù)應(yīng)用范圍廣。
3、送樣建議
細(xì)胞樣本
聯(lián)系我們上門(mén)服務(wù)（提前10個(gè)工作日預(yù)約）。
血液樣本
抽取5ml人外周血加入到EDTA抗凝管中，分離PBMC后，聯(lián)系我們上門(mén)服務(wù)（提前10個(gè)工作日預(yù)約）。
組織樣本
方案一：取新鮮組織進(jìn)行組織解離后，制備為細(xì)胞懸液，聯(lián)系我們上門(mén)服務(wù)（提前10個(gè)工作日預(yù)約）；
方案二：新鮮組織取黃豆大小（1-2mm3）剪碎后置于保存液（公司提供）中，48h內(nèi)冰袋運(yùn)輸?shù)轿宜?。每個(gè)樣本至少準(zhǔn)備兩管，一管作為備份。
注意事項(xiàng)：冰袋若從-80℃拿出，需放4℃冰箱2h。
4、技術(shù)流程
5、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序信息分析
1測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控和定量
1.1測(cè)序序列統(tǒng)計(jì)與質(zhì)控
1.2數(shù)據(jù)定量
1.3多樣本數(shù)據(jù)合并和定量均一化
1.4最終鑒定細(xì)胞表達(dá)量矩陣
2細(xì)胞亞群分類
2.1細(xì)胞過(guò)濾
2.2單細(xì)胞亞群分類
3 Marker基因分析
4差異富集分析
4.1差異基因GO富集性分析
4.2差異基因KEGG富集性分析
5高級(jí)分析
5.1已知基因在細(xì)胞亞群表達(dá)分布及熱圖
5.2細(xì)胞分化擬時(shí)序分析
5.3細(xì)胞相互作用圖譜
5.4加權(quán)基因共表達(dá)（WGCNA）分析
5.5蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析
5.6細(xì)胞周期鑒定
6、結(jié)果展示
圖1 PCA基因熱圖
圖2 單細(xì)胞亞群分類tSNE圖
圖3 擬時(shí)序軌跡圖
（擬時(shí)序分析（pseudotime），即構(gòu)建細(xì)胞譜系發(fā)育，主要是判斷不同細(xì)胞表達(dá)量之間的關(guān)系，不同亞群之間表達(dá)量過(guò)渡的變化就是一條軌跡，這個(gè)時(shí)間并不是真的時(shí)間，而是一個(gè)虛擬的時(shí)序列，是指細(xì)胞與細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)化和演替的順序和軌跡。Monocle是我們經(jīng)常用的擬時(shí)序分析工具，通過(guò)R語(yǔ)言讀取seurat對(duì)象后可進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，基于某些Marker基因表達(dá)模式，進(jìn)而描繪細(xì)胞在隨時(shí)間發(fā)育過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化。）
圖4 擬時(shí)序變化相關(guān)基因（Top10\ Top50）表達(dá)分布圖\熱圖
7、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序案例分析
Nature Immunology狼瘡性腎炎患者的腎臟免疫細(xì)胞組成單細(xì)胞測(cè)序分析
圖5 細(xì)胞亞型聚類圖
通過(guò)對(duì)LN患者和健康個(gè)體的腎臟、血液和尿液樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，結(jié)果顯示，血液與腎臟中檢測(cè)到的細(xì)胞分子特征存在相似性和差異性，而尿液與腎臟中白細(xì)胞亞群的分子活化狀態(tài)高度相關(guān)，有望作為腎臟活檢的代替物。
使用低分辨率聚類將所取腎臟細(xì)胞分為了10個(gè)集群，基于譜系標(biāo)記基因和其他基因上調(diào)，將集群標(biāo)記為髓細(xì)胞（C4, C6）、T/NK細(xì)胞（C0, C1, C2, C5）、B細(xì)胞（C3, C8）、分裂細(xì)胞（C9）和腎上皮細(xì)胞（C7）。接下來(lái)，將每個(gè)譜系的細(xì)胞分別進(jìn)行聚類，一共確定了21個(gè)免疫細(xì)胞集群和一個(gè)上皮細(xì)胞集群（圖2）。
研究利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究從LN患者和活體供體對(duì)照中獲得的腎臟樣本，揭示了LN腎臟免疫群體的復(fù)雜性，識(shí)別了髓細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等多種疾病特異性亞群。研究發(fā)現(xiàn)：大量的分裂細(xì)胞和NK細(xì)胞，表明IFNγ和細(xì)胞溶解分子的主要來(lái)源，CD8+ T細(xì)胞中衰竭標(biāo)記的少量表達(dá)表明了LN中的細(xì)胞毒性。浸潤(rùn)白細(xì)胞的干擾素反應(yīng)特征與血液中的相同特征相關(guān)，趨化因子受體CXCR4和CX3CR1在腎臟免疫細(xì)胞中頻繁表達(dá)，提示它們可能是潛在的治療靶點(diǎn)，尿液免疫細(xì)胞基因表達(dá)與相應(yīng)的腎臟白細(xì)胞高度相關(guān)。
參考文獻(xiàn) ：
[1] Arazi A., Rao, D. A., et al. (2019). The immune cell landscape in kidneys of patients with lupus nephritis. Nature Immunology.
